2 Matériels et méthodes

Table des matières - Précédente - Suivante

2.1 Site d'essais
2.2 Matériels utilisés
2.3 Méthodes
2.4 Essais en conteneurs
2.5 Essais réalisés dans des conditions semi-pratiques
2.6 Evaluation statistique

2.1 Site d'essais

Les essais se sont déroulés au Service national de la Protection des Végétaux à Cacaveli, au Togo. La "Direction de la Protection des Végétaux" (P.V.) est implanté au nord de Lomé, la capitale, à dix kilomètres environ du centre ville. Le laboratoire dans lequel ont été effectués les essais en conteneurs se trouve dans un bâtiment isolé. Les murs sont percés de fenêtres étroit es et dépourvues de vitrage, ce qui empêche largement la lumière de pénétrer dans les locaux et a préserve ainsi les insectes d'une exposition intense au soleil. Vu le mode de construction ouvert, il règne dans le laboratoire le climat chaud et humide qui caractérise le pays. Les conditions climatiques étaient par conséquent identiques à celles rencontrées par les coléoptères dans leur milieu naturel.

Le laboratoire togolais ne possédant pas l'appareillage requis par ces travaux spéciaux, les agents pathogènes des insectes ont été examines en Allemagne. Les examens ont eu lieu à Darmstadt, au département de protection biologique des végétaux de l'institut biologique fédéral (BBA).

2.2 Matériels utilisés

Constitution et entretien des élevages de Prostephanus truncatus

Les essais prévus nécessitaient la mise en place de deux élevages distincts de P. truncatus. De manière à avoir en permanence suffisamment de matériel à inoculer, on à conserve d'une part les protozoaires dans un élevage dit "infectieux" et procédé à leur multiplication. Les individus composant cet élevage provenaient d'un grenier à maïs infesté, installe sur le terrain d'essai de Cacaveli. Du fait que les populations naturelles du coléoptère sont déjà infestées, jusqu'à un certain degré, par des protozoaires, ces animaux présentaient un taux d'infection "naturelle". On s'est efforce d'obtenir un taux d'infection aussi élevé que possible au sein de la population d'insectes en ajoutant régulièrement des spores de protozoaires.

Il a fallu d'autre part constituer un élevage de P. truncatus sains pour servir d'animaux expérimentaux. Dans la mesure où la contamination par les protozoaires ne s'accompagne dans la plupart des cas chez les d'aucun symptôme visible il n'a pas été possible de sélectionner les sujets sains parmi une population de ravageurs contaminés naturellement. Il s'agissait donc tout d'abord de trouver des sujets non contamines. Afin de préserver ces individus on a élevé isolement plusieurs couples de l'anobie. Après que ces couples se soient reproduits on a retiré les parents afin de déceler chez eux une infestation éventuelle par des protozoaires. Dans les cas oú les résultats d'examen ont été négatifs, on a pu en conclure que la descendance était également exempte d'infestation et pouvait être utilisée pour l'élevage d'animaux sains. En renforcement de cette mesure on a procédé a des contrôles réguliers dans les bocaux d'élevage pour vérifier que les animaux étaient exempts de toute infestation par des protozoaires.

Dans le but de préserver l'hygiène à l'intérieur de l'élevage on a retire de temps à autre des bocaux de verre la poussière résultant de l'activité alimentaire, de même que les cadavres d'insectes et rajoute du substrat nutritif. La présence d'acariens a posé des problèmes particuliers. Afin de prévenir une contamination par ces animaux les bocaux d'élevage et les bocaux à essai ont été systématiquement places dans des assiettes de plastique remplies de paraffine. Pour maintenir les acariens à distance les étagères supportant les bocaux ont été nettoyées chaque semaine dans une lessive savonneuse. Les pieds des étagères ont été eux aussi placés dans des conteneurs remplis de paraffine

Origine et conservation du substrat nutritif

Comme substrat nutritif pour les élevages et les bocaux a essai, on a choisi diverses espèces locales de maïs présentées sous forme de grains en vrac. Ce maïs provenait des zones de culture situées dans le sud du Togo. Après dépanouillage et égrenage des épis, les grains intacts ont été triés, tamisés et placés dans des sachets de plastique pour congélation. Ce processus visait à tuer les insectes nuisibles et les acariens éventuellement demeures dans le grain. A l'issue d'une période minimale de congélation d'une semaine les grains ont été décongelés et utilises pour les (levages ou les préparations destinées aux essais.

Appareillage et produits chimiques utilisés

Comme conteneurs d'élevage et d'essai, on a choisi des bocaux de 1 l (marque Leifheit, type "Einkochspaß" ). Ces bocaux se sont révélés particulièrement adaptés en raison de la perforation pratiquée dans le couvercle, dans laquelle on a mis un morceau de treillis en acier spécial découpé sur mesure permettant d'assurer une alimentation suffisante des insectes en oxygène. S'agissant du couvercle, le choix du matériau présentait certaines difficultés dans la mesure ou l'anobie est capable de traverser de nombreux matériaux (cf. DETMERS, 1988), ce qui explique que l'on ait choisi un treillis à mailles fines en acier spécial.

Pour les essais ne réunissant qu'un nombre restreint d'individus, on a utilisé de petits bocaux à collet de 10 ou de 50 ml. Le choix des conteneurs a été en l'occurrence dicté par le nombre d'individus à placer dans chèque bocal.

2.3 Méthodes

2.3.1 Recensement de Ia présence naturelle d'agents pathogènes sur Prostephanus truncatus au Togo
2.3.2 Examen d'une éventuelle infestation des insectes par des protozoaires
2.3.3 Coloration des spores et étude du cycle évolutif
2.3.4 Examen histopathologique
2.3.5 Confection de la préparation aux spores de protozoaires et déteramination de la concentration des spores

2.3.1 Recensement de la présence naturelle d'agents pathogènes sur Prostephanus truncatus au Togo

Afin de déterminer de l'infestation naturelle de P. truncatus. par des agents pathogènes au Togo, on a procédé en janvier et février 1989 a un recensement dans les principales zones de distribution du ravageur des stocks. Les greniers à maïs inspectes chez les petits paysans étaient repartis au total sur 108 villages. L'objectif consistait ici à déceler une éventuelle infestation due à l'anobie.

Dans l'un des greniers, qui présentait des signes visibles de la présence de P. truncatus. on a ôté les (pis infestés pour les conserver dans des sacs de coton. Le même jour, on a séparé au laboratoire les coléoptères vivants trouvés sur les épis des coléoptères morts. Les animaux vivants ont été ensuite tues à l'acétate d'éthyle. Pour chaque lieu de découverte, on a sélectionné au maximum, suivant le principe de hasard, 12 coléoptères vivants et 12 coléoptères morts afin de rechercher sur eux une éventuelle infestation par des agents pathogènes.

2.3.2 Examen d'une éventuelle infestation des insectes par des protozoaires

Les animaux infectes ont été examines systématiquement par la méthode du diagnostic individuel. Pour effectuer cette analyse, on a nettoyé l'insecte a examiner dans de l'eau distillée afin d'en retirer la farine de maïs issue de l'activité alimentaire. On a ensuite détaché la tête, le thorax et les élytres. L'abdomen a été place sur un porte-objet et écrasé dans une goutte d'eau distillée. Cette préparation écrasée dite "de l'état naturel'. a ensuite été examinée au microscope afin d'y déceler d'éventuelles spores de protozoaires. L'enveloppe de l'abdomen a été conservée en vue d'autres examens.

En présence d'un nombre élevé de sujets, comme dans le cadre des essais portant sur la dynamique des populations, il n'a pas été possible d'examiner tous les animaux individuellement. Pour déterminer le taux d'infection, on a prélevé ici un échantillonnage de 50 individus. Selon nos propres tests, le taux d'infection constaté sur cet échantillonnage correspondait largement au taux d'infection effectivement relevé sur l'ensemble des animaux examinés

2.3.3 Coloration des spores et étude du cycle évolutif

Il s'agit dans l'expose qui suit de méthodes standardisées pour l'examen des agents pathogènes des insectes. Les travaux ont été réalisés avec l'aimable collaboration du Dr Huger de Darmstadt (BBA).

Là où le diagnostic était positif, on a confectionné plusieurs frottis secs, obtenus à partir de l'abdomen de l'animal infecté, lequel contenait des spores. Apres 10 minutes de fixation sans du méthanol, les frottis ont (té colorés pendent 60 minutes au Giemsa. Les préparations colorées ont été recouvertes d'Entellan. De manière à déterminer les dimensions des spores de Nosema et de Mattesia. on a photographie les divers stades de l'évolution. Afin d'établir le rapport nucléaire a l'intérieur des spores de Nosema, on a confectionné des colorations de noyau. S'agissant de ce type de coloration, les frottis secs ont été hydrolysés après fixation dans 1 N de solution d'HCl à 55 ºC. La coloration optimale des noyaux au Giemsa a été obtenue après 10 minutes d'hydrolyse.

Autre caractéristique des spores de Nosema c'est-à-dire la longueur de leur filament polaire. Dans le but d'examiner cette caractéristique plus en détail, on a utilise des préparations de l'état naturel séchées, dans lesquelles, ainsi que l'expérience l'a montre, les spores éjectent leur filament polaire. Les photos prises on: permis de mesurer la longueur de ces filaments polaires.

L étude du cycle évolutif de l'espèce Nosema devrait permettre d'en tirer des conclusions quant à son identité. Pour pouvoir décrire les Stades intermédiaires de la microsporidie, on a préparé dans un premier temps des larves infestées. Après avoir tut et nettoyé les sujets, on a procédé à une coupe ventrale longitudinale, suivie de l'ablation du corps adipeux, des gonades et de l' intestin moyen La coloration au Giemsa des frottis d'organes fixés a été effectuée selon la méthode connue. Les préparations ont été ensuite examinées d'in d'établir les stades du développement de l'espèce Nosema. Ces stades ont été photographiés, de façon à pouvoir décrire à l'aide des photos le cycle évolutif du protozoaire.

2.3.4 Examen histopathologique

Dans le but d'identifier les microsporidies, on a étudié les transformations histologiques intervenant dans l'animal hôte infesté. La confection de coupes sagittales sert à rendre visible chacun des organes de l'animal hôte, ce qui permet de les examiner pour y déceler une infection éventuelle. On a donc procédé sur les larves de Nosema à toute une série de coupes de ce type.

Les larves infestées ont tout d'abord été incluses dans de la cire. On a ensuite procédé sur ces larves à des coupes transversales de 8 µm d'épaisseur. Pour être certain d'atteindre tous les organes, on a sectionne l'animal jusqu'en son milieu. Les coupes microscopiques ont été ensuite colorées à l'hématoxyline-liquide de Heidenhain. Le procédé utilise était conforme à une méthode standardisée (HUGER, communication orale).

2.3.5 Confection de la préparation aux spores de protozoaires et détermination de la concentration des spores

Pour obtenir une préparation aux spores de protozoaires réunissant les deux agents pathogènes, on a employé des coléoptères morts provenant de l'élevage infeste, à partir desquels on a confectionné dans un mortier une poudre très fine. Pour certains essais, toutefois, l'inoculation d'un seul type de spores était requise. Pour réaliser les préparation aux spores simples, on a transformé les cadavres des animaux déjà examines en une poudre hautement concentrée de spores de Mattesia et de Nosema. Des P. truncatus sains ont été alors placés sur le substrat ainsi obtenu, ce qui fait que leur descendance a elle aussi été contaminée par l'un ou l'autre des protozoaires, Ce sont ces animaux infestes qui ont été utilisés pour la confection des préparations simples.

La concentration des spores dans chaque préparation a été déterminée selon une méthode unique, dont nous allons traiter ici sous une forme résumée. Cette concentration on a été déterminée sur la base d'un échantillonnage de 20 mg de chaque type de préparation aux spores. Chacun des échantillons a été placé en suspension dans I ml d'eau distillée, puis centrifuge durant quelques minutes dans une centrifugeuse manuelle. Le reste, qui contenait les spores détachées. a été transféré à l'aide d'une pipette dans un hématimètre de Thoma, dans lequel on a effectue la numération des spores. La moyenne des résultats obtenus à la suite d'un triple comptage a permis d'établir la concentration de spores dans l'ensemble de la préparation. Dans d'importantes quantités de préparations aux spores utilisées pour les essais en greniers, la détermination de la concentration a été opérée à partir de plusieurs échantillons de 20 mg.

2.4 Essais en conteneurs

2.4.1 Inoculation de spores de protozoaires a des larves et à des adultes de Prostephanus truncatus
2.4.2 Observation de couples infestes par Mattesia
2.4.3 Traitement de populations de Prostephanus truncatus aux spores
2.4.4 Inoculation de spores stockées
2.4.5. Essais de transmissibilité des spores de protozoaires à d'autres espèces de coléoptèras
2.4.6 Traitement combiné aux insecticides et aux préparations aux spores de protozoaires

2.4.1 Inoculation de spores de protozoaires a des larves et à des adultes de Prostephanus truncatus

Les différents stades du développement de P. truncatus ont été inocules avec des spores de Mattesia et de Nosema afin que l'on puisse étudier pour chaque stade les effets pathogènes de ces deux protozoaires. Les larves et les adultes ayant été inocules selon des procédés différents. nous décrirons dans la suite ces procédés l'un après l'autre.

Inoculation des larves

Les traitements aux spores de Nosema et de Mattesia ont été respectivement appliqués à 16 larves saines des ler, 2ème et 3ème stades (L1, L2 et L3) de P. truncatus. Pour identifier les stades larvaires, on a mesuré la largeur de la capsule Céphalique (d'après SUBRAMANYAM et al., 1985). Dans un petit bocal à collet, rempli pour moitié environ de farine de maïs comprimée, on a place quatre larves du même stade. Ces larves ont Eté positionnées à la surface de la poussière, dans des cavités préformées, puis saupoudrées uniformément de 40 mg de chacune des poudres aux spores. On a ainsi introduit dans chaque verre 2x10⁷ spores de Nosema et 4x10⁶ spores de Mattesia. Apres avoir ainsi traite les larves, on a verse à nouveau de la farine de maïs dans les conteneurs, en ne la comprimant cette fois que légèrement Les conteneurs ont été refermes au moyen d'un morceau de gaze.

Là où l'on a utilisé de la farine de maïs non tamisée le taux de mortalité des larves était dans l'ensemble élevé ce qui a conduit à répéter les inoculations de I mm de farine de maïs finement tamisée Chaque conteneur contenait 6x10⁷ spores de Nosema et 4x10⁵ spores de Mattesia. A l'issue d'une période d'essai de 19 jours pour L3, de 26 jours pour L2 et de 33 jours pour L1, on a établi les taux de développement et de mortalité et dénombré les animaux contaminés.

Inoculation des adultes

Afin de vérifier leur prédisposition, on a inoculé aux adultes de P. truncatus les deux types de spores en mélangeant la poudre contenant les spores aux grains de maïs en vrac. Pour ce qui est du traitement aux spores de Nosema, on a utilisé douze bocaux à collet de 10 ml, que l'on a remplis à chaque fois de 5 g de maïs en grains. Dans quatre de ces bocaux, on a introduit la préparation à une concentration de 8X10⁶ spores pour 1 g de substrat. Dans quatre autres bocaux, on a introduit 8x10⁵ spores par gramme de substrat. Les quatre bocaux restants n'ont pas été traités. On a ensuite placé dans chaque conteneur 20 spécimens sains de P. truncatus. Pour l'inoculation des spores de Mattesia, on a rempli douze bocaux à collet de 25 g de maïs en grains. Quatre de ces bocaux ont été traités au moyen de 4x10⁴ spores et quatre autres au moyen de 2x10⁴ spores par g de substrat. Les bocaux restants n'ont pas été traités. On a ensuite placé dans chaque bocal 30 adultes de P. truncatus. Dans les deux essais a inoculation, les coléoptères ont été examinés au bout de trois semaines afin de déceler une infestation éventuelle par les protozoaires.

2.4.2 Observation de couples infestes par Mattesia

Dans le but de déterminer la fécondité et la longévité du ravageur à la suite d'une infestation par Mattesia, on a place en observation des couples de P. truncatus dont les mâles ou les femelles étaient infestés par l'espèce Mattesia. 200 larves exemptes d'infestation ont tout d'abord été préparées, Apres qu'ils aient atteint la forme adulte, les animaux retirés des bocaux d'élevage présentaient une teinte légèrement brune. Cette coloration permet de conclure que le corps chitineux protégeant les coléoptères des blessures au cours de la métabolisation avait déjà atteint une dureté suffisante. On a ensuite déterminé le sexe à partir d'une caractéristique secondaire localisée sur la tête des insectes (d'après SHIRES & McCARTHY, 1976).

Mâles et femelles ont d'abord été élevés séparément, la moitié des sujets étant places sur un substrat contenant des Mattesia. Ce substrat était composé de grains de maïs en vrac, qui avaient été humidifiés avec de l'eau, puis contaminées par des spores. A la suite d'une période d'incubation de quatre jours, on a procédé à la formation des couples suivants :

• 10 couples de P. truncatus sains
• 10 couples composes de femelles saines et de mâles infectés et
• 10 couples composes de femelles infectées et de mêles sains.

Le dénombrement des oeufs pondus a commencé entre quatre et six jours après le début de l'essai. Le comptage s'est poursuivi durant 10 semaines, à intervalles de quatre jours. Avant de retirer les oeufs des bocaux à essai, on a sorti les adultes pour les examiner. Les animaux vivants ont été replacés dans les conteneurs. A l'aide d'un pinceau, on a extrait avec précaution la farine de maïs et les oeufs qu'elle contenait des grains attaques, puis séparé dans un tamis à mailles de 0,315 T les oeufs de la farine de maïs. Les oeufs, qui sont très fragiles, ont été rassembles à l'aide d'un pinceau en poils de martre, nettoyés à l'eau distillée puis places dans une boite de Petri pour que l'on puisse observer quotidiennement l'éclosion des larves. Les larves fraîchement écloses ont été immédiatement examinées en vue de déceler une infestations par Mattesia. A chaque fois qu'une femelle mourait durant l'essai, on a tue le mâle pour l'examiner; dans le cas inverse, on a continue a observer la femelle survivante.

2.4.3 Traitement de populations de Prostephanus truncatus aux spores

Les deux essais suivants avaient pour objectif d'observer la dynamique des populations de P. truncatus sous l'influence des spores de protozoaires, Lors du premier essai, on a pris 60 spécimens de P. truncatus des deux sexes provenant d'un grenier à maïs et présentant par conséquent un certain degré d'infection naturelle par des protozoaires. Le second essai a été effectué sur 10 mâles et femelles issus de l'élevage sain. Le procédé utilise était le même pour les deux essais.

On a versé dans six conteneurs en verre de 1 l de contenance 300 g de grains de maïs. Dans trois de ces conteneurs, on a mélangé au grain une préparation mixte contenant des spores; les trois autres conteneurs n'ont pas été traités. Dans le premier essai, on a traité à une concentration de 3x10⁵ spores de Nosema et de 8x103 spores de Mattesia par g de substrat, tandis que dans le second la concentration était de 3,5x10⁵ pour les spores de Nosema et de 3x10³ pour les spores de Mattesia.

Au bout de 4, 8, 12 et 16 semaines, on a procédé à l'évaluation des conteneurs. Pour ce faire, on a verse le contenu de chaque récipient dans un jeu de tamis comprenant un fond, ainsi qu'un tamis de 0,4 T, un de 0,8 T et un de 3,15 T. Le tri des individus a été facilite par l'utilisation de tamis à mailles de différentes largeur. Les imagos, morts et vivants, de même que les larves mortes, ont été retirés du tamis séparément, puis dénombrés. On a ensuite prélevé un échantillonnage de 50 individus, représentant tous les stades du développement de P. truncatus, afin de rechercher une infection par des protozoaires. La farine de forage et les grains ont été replacés dans leurs conteneurs respectifs pour permettre d'observer le développement ultérieur du reste des oeufs, des papes et des larves de l'anobie. A l'issue d'une période d'essai de 16 semaines, on a dénombré dans chaque conteneur la totalité des individus.

2.4.4 Inoculation de spores stockées

Il s'agissait de vérifier par deux essais si la contagiosité des spores de Nosema et de Mattesia diminuait à la suite d'un stockage. Un autre essai avait pour but d'établir à quelle température les spores pouvaient survivre le plus longtemps.

Pour répondre à la première question, on a stocke les spores dans des cadavres d'animaux durant des périodes plus ou moins prolongées. Il s'agissait en l'occurrence d'animaux provenant de l'élevage de P. truncatus à infection mixte. Pour préparer les poudres aux spores, on a moulu simultanément les coléoptères morts qui avaient été conservés pendant la même durée. Les diverses poudres aux spores ont été alors inoculées au moyen de la méthode connue à 20 larves de P. truncatus par type de poudre (cf. chap. 2.4.1).

Un traitement réalisé sur la base d'une préparation confectionnée à partir de spores récentes fournissait le témoin. La durée de conservation et les quantités de spores appliquées figurent au tableau 1. Par rapport à l'essai 1, on a utilisé pour le traitement de l'essai 2 une quantité de poudre trois fois supérieure, ce qui fait que le nombre de spores par conteneur a triple. Les animaux infectés ont été dénombrés au bout de 14 jours (essai 1) et de 10 jours (essai 2).

Dans le cadre d'un autre essai, on a conserve la préparation aux spores mixtes a différentes températures. Apres que l'on ait eu détermine la concentration de spores, la poudre a été divisée en 6 portions égales et conservée dans des sachets de plastique. On a stocké au laboratoire deux sachets de chaque sorte, d'une part à la température normale (23 a 32 ºC), en réfrigérateur entre 4 et 10 ºC, et enfin en congélateur par une température de -12 à -22 ºC. Au bout de deux mois, on a retiré un sachet de chacune des zones de température afin d'inoculer les spores de conservation au ravageur. L'opération a été répétée par la suite avec les trois autres sachets au bout de huit mois de stockage.

Tabl. 1: Durée de stockage des cadavres d'animaux et des spores de Nosema (No.sp.) et de Mattesia (Ma.sp.) appliquées respectivement à 4 larves de Prostephanus truncatus (essais 1 et 2)

Comme animaux expérimentaux, on a pris 40 larves de P. truncatus saines, que l'on a traitées aux différentes poudres de spores en vertu de la méthode précédemment décrite. La quantité appliquée à l'ensemble des variantes était de 2X10⁸ spores de Nosema et de 6x10⁵ spores de Mattesia. par conteneur. A l'issue d'une période d'essai de 10 jours, on a compte le nombre de sujets infectés.

2.4.5. Essais de transmissibilité des spores de protozoaires à d'autres espèces de coléoptères

Il est fréquent que le spectre d'hôtes des protozoaires pathogènes des insectes ne soit pas limite à un hôte unique, mais que les protozoaires infestent au contraire diverses espèces d'insectes. Il s'agissait donc de voir si les espèces Mattesia et Nosema étaient elles aussi en mesure d'infester d'autres coléoptères. Outre les six ravageurs des stocks retenus pour ce test, on y a également intégré T. nigrescens. Eu égard à l'essaimage de cet antagoniste efficace de P. truncatus, prévu au Togo pour la fin de 1990, il était en effet important' du point de vue pratique, de vérifier chez lui une prédisposition éventuelle.

Inoculation des ravageurs des stocks

On trouvera au tableau 2 la liste des espèces de ravageurs des stocks choisis pour l'essai, ainsi que les divers substrats sur lesquels ils ont été placés. Les substrats nutritifs utilisés sont ceux sur lesquels les coléoptères concernes ont été trouvés à l'origine. Du fait que les élevages d'insectes étaient déjà tous infestes par des microsporidies et que l'on y avait observe dans certains cas des infections dues à des néogrégarines, il a fallu dans un premier temps sélectionner des animaux sains. Le procédé employé en l'occurrence était identique à celui décrit au chapitre 2.2, concernant l'élevage de P. truncatus exempts d'infestation.

La descendance saine des ravageurs a été soumise a un traitement aux spores compose de poudres aux spores mixtes hautement concentrées (de 3x10⁷ à 8x10⁸ spores de Nosema et de 5x10⁵ à 1x10⁷ spores de Mattesia. par conteneur). Un contrôle d'infestation a été effectué au bout de à semaines (4 semaines pour D. bifoveolatus).

Tabl. 2 : Ravageurs des stocks à qui ont et scores de ptotozoaires

Essai destiné à établir la prédisposition de Teretriosoma nigrescens dans une population de P. truncatus infestée

Dans le cadre de cet essai préliminaire, on a place 30 adultes de T. nigrescens sur une population de P. truncatus fortement infestée par des protozoaires. Au bout de 13 semaines, on a vérifié le contenu du récipient afin de recenser les P. truncatus survivants et de rechercher sur les T. nigrescens une éventuelle infection par les protozoaires.

Essai avec des proies infestées

Apres avoir pris 25 boîtes de Petri en verre et en avoir garni le fond d'un morceau de papier, on a introduit dans chacune d'elles 4 larves et 4 adultes de P. truncatus infestes, puis 1 adulte de T.nigrescens par boite. De la même manière, 30 larves de T. nigrescens ont été nourries avec des larves malades de l'anobie. Au bout de 6 jours environ, on a remplacé dans toutes les boites les proies infestées par des proies saines, et cela de manière à éviter un diagnostic d'infestation positif dû à la présence de spores dans l'appareil digestif de T. nigrescens. Pour être à peu près certain que l'appareil digestif des prédateurs était exempt de spores, on a ensuite nourri ces prédateurs pendant 24 jours avec des proies saines. Ce n'est qu'à l'issue de cette période que l'on a examine les T. nigrescens dans le but de déceler chez eux une éventuelle infestation par des protozoaires.

2.4.6 Traitement combiné aux insecticides et aux préparations aux spores de protozoaires

Dans la perspective du développement d'une stratégie de lutte biologique intégrées il est indispensable de connaître les interactions des principes actifs et des spores de protozoaires. Il s'agissait par conséquent de déterminer, dans le cadre d'un essai préliminaire, si la contamination de spores de protozoaires par une poudre insecticide atténue la virulence des spores. A la suite de cela, on a donc applique simultanément du pirimiphos-méthyle (la concentration de matière active de la préparation utilisée, qui s'appelle dans le commerce "Actellic", est de 2 %) associé à la préparation aux spores, aux fins d'étudier les effets d'un traitement combiné sur la population de P. truncatus.

Essai préliminaire

On a tout d'abord pilé grossièrement dans un mortier quelques centaines de P. truncatus morts provenant de l'élevage infesté, puis prélevé sur cette fraction écrasée une quantité de 20 mg, qu'on a moulus finement dans le but d'établir la concentration de spores (cf. chap. 2.3.5). La fraction écrasée a été ensuite divisée en à portions identiques, qui ont été placées dans des boites de Petri. On a me ange à chaque lot de la poudre de pirimiphos-méthyle ou de deltaméthrine (la concentration de matière active de la préparation utilisée, qui s'appelle dans le commerce "K-Othrine", est de 0,2%).

Au bout de 4 semaines de contamination, les insecticides pulvérisés ont été soigneusement isolés des particules de coléoptères à l'aide a un tamis de 1 mm. Apres nettoyage, les particules de coléoptères ont été moulues en une fine poudre aux spores, laquelle a été inoculée, selon le procédé habituel, à 40 larves de P. truncatus saines pour chaque type de poudre. Chaque conteneur renfermait en moyenne 5x10⁶ spores de Nosema et 3x10⁵ spores de Mattesia. Le contrôle d'infection des sujets est intervenu au bout de 13 jours.

Traitement de P. truncatus au pirimiphos-méthyle et aux spores de protozoaires

Partant du fait que le "pirimiphos-méthyle", qui est une liaison organophosphorée, s'est avéré dans le passé une matière active insecticide moins efficace que les pyréthroïdes synthétiques pour lutter contre P. truncatus (GOLOB et al., 1985), on a voulu ici analyser sur le ravageur les effets de la matière active associée à des spores de protozoaires. Pour ce faire, on a place dans des conteneurs en verre de 1 l 300 g de grains de maïs, mélangés à du pirimiphos-méthyle et des spores, et cela aux concentrations indiquées au tableau 3. S'agissant de la mise en oeuvre combinée, on a mélangé les préparations avant l'application. Chaque conteneur a accueilli 10 mâles et femelles de P. truncatus sains.

Les populations de ravageurs ont pu se développer librement dans les conteneurs pendant 4, 8 et 12 semaines, étant donne que l'on a prélevé à l'issue de chacune de ces périodes trois conteneurs par variante, que l'on a éliminé dores évaluation. Cette méthode a permis de recenser à la fin de chaque période la totalité des sujets sains d'une population. L'opération ayant été répétée trois fois pour chaque variante, il a fallu utiliser neuf conteneurs par traitement. Au sein des populations traitées aux spores, on a déterminé les taux d'infection sur un maximum de 50 animaux par stade de développement.

Tabl. 3 : Variantes traitées en conteneur à l'Actellic et aux spores de protozoaires (20 P. truncatus par conteneur)

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